Pero contrariamente a las creencias populares, los murciélagos no son ciegos, ya que muchos además de su sistema de sonar, emplean la vista para diferentes actividades. A diferencia de los micromurciélagos (suborden Microchiroptera), los megamurciélagos (suborden Megachiroptera) emplean la visión para orientarse y localizar a sus presas (una única especie de este suborden ha desarrollado un mecanismo de ecolocación que utiliza sólo cuando vuela en total oscuridad). Los ojos de los megamurciélagos están más desarrollados que los de los micromurciélagos y, en general, ningún murciélago está completamente ciego.
Los murciélagos, al igual que los delfines o los cachalotes, utilizan la ecolocalización, un sistema de percepción que consiste en la emisión de sonidos, para producir ecos que a su retorno se transmiten al cerebro a través del sistema nervioso auditivo y les ayuda a orientarse, detectar obstáculos, localizar presas o con motivos sociales; se trata de una especie de «sonar» biológico. La utilizan fundamentalmente para la captura de sus presas y les proporciona información sobre su medida, velocidad y dirección. Generan el ultrasonido en la laringe y lo emiten a través de la nariz o por la boca abierta. La llamada del murciélago utiliza una gama de frecuencias comprendida entre 14 000 y 100 000 Hz, frecuencias la mayoría por encima de la capacidad auditiva del oído humano (de 20 Hz a 20 000 Hz).
Las frecuencias pueden ser constantes (no cambian durante la duración de la señal) o moduladas (varían en mayor o menor medida). Los gritos pueden acabarse repentinamente o gradualmente, según la especie. Los megadermátidos, filostómidos, nictéridos y algunos vespertiliónidos utilizan intensidades débiles, mientras que el género Nyctalus tiene llamamientos muy potentes que se pueden sentir desde una distancia muy superior. En ocasiones dejan de emitir sonidos cuando se encuentran en lugares familiares o que conocen bien, quizás para evitar que determinados predadores los descubran.
Durante la búsqueda de presas emiten de media 4-12 señales de búsqueda por segundo en intervalos irregulares; cuando localizan una posible presa, durante la persecución el ritmo de las señales aumenta significativamente (hasta 40-50 por segundo), y justo antes de capturarlas emiten un «zumbido final» consistente en una secuencia de 10-15 pulsos cortos separados por un intervalo mínimo. La secuencia completa de localización, persecución y «zumbido final» dura menos de 1-2 segundos.
Utilizan las orejas para escuchar su propio eco, y las de algunos grupos, como por ejemplo los rinolófidos, pueden moverse independientemente la una de la otra. Calculan la distancia de la presa por la diferencia de tiempo entre la emisión del sonido y la recepción del eco, y la dirección la deducen por la diferencia entre la llegada del eco al oído derecho y al izquierdo. El pabellón auricular de los quirópteros está adaptado al tipo de vuelo de cada especie; cuanto más rápido vuelan, más cortas son las orejas.
Estas imágenes grabadas a cámara lenta muestran cómo los murciélagos también utilizan la ecolocalización para encontrar agua.